دستگاه ترموسایکلر | Thermocycler

دستگاه ترموسایکلر 

دستگاه ترموسایکلر چیست | قیمت ترموسایکلر | فروش ترموسایکلر | دستگاه پی سی آر | دستگاه ترموسایکلر | دستگاه ترموسایکلر چیست | دستگاه ترموسایکلر چیست | دستگاه ترموسایکلر چیست |  دستگاه ترموسایکلرچیست | دستگاه ترموسایکلر چیست | دستگاه ترموسایکلر چیست | قیمت | قیمت | قیمت | خرید | خرید | خرید | خرید | خرید | خرید | قیمت | قیمت | قیمت | خرید | چیست | چیست | دستگاه پی سی آر | دستگاه پی سی آر | دستگاه پی سی آر | دستگاه پی سی آر | دستگاه پی سی آر | دستگاه پی سی آر

تکنیک PCR

اگر نیاز به کپی متعدد از توالی یا تعیین کمیت DNA باشد، تکنیک PCR بسیار مناسب خواهد بود. به طور خلاصه، PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یک تکنیک بیوشیمیایی است که با استفاده از تغییرات حرارتی و آنزیم ها، کپی سریع و قابل اعتماد DNA را انجام می دهد، و این دانش با الهام از یک دانشمند که در بزرگراه ۱۲۸ از سانفرانسیسکو تا مندوچینو رانندگی می کرد، اختراع شد.

به عبارتی PCR یک تکنیک آزمایشگاهی برای تکثیر هدفمند بخش های اسید دئوکسی ریبونوکلئیک (DNA) است.

کاربرد های PCR

شناسایی و توصیف عوامل عفونی

تشخیص مستقیم میکروارگانیسم ها در نمونه های بیمار

شناسایی میکروارگانیسم های رشد یافته در محیط کشت

تشخیص مقاومت آنتی میکروبیال

بررسی رابطه وابستگی به سویه از یک عامل بیماریزای مورد نظر

اثر انگشت ژنتیکی (برنامه پزشکی قانونی / آزمایش والدی)

تشخیص جهش (بررسی بیماریهای ژنتیکی)

ژن های شبیه سازی

مواد اولیه برای PCR

آنزیم پلیمراز

پلی مرازها آنزیم هایی هستند که در شرایط مناسب می توانند رشته های جدید DNA را از DNA الگو و نوکلئوتیدها بسازند. در ابتدا واکنش اصلی PCR با مشکل مواجه  بود زیرا درجه حرارت بالا برای تکنیک تکثیر DNA باعث از بین رفتن پلیمرازها می شود. این بدان معنی بود که پس از هر سیکل گرمایش، پلیمرازهای جدید باید به صورت دستی به واکنش اضافه می شدند (یک تلاش گران قیمت). اما در PCR مدرن این مسئله مشکلی نیست، زیرا پلیمرازهای مورد استفاده در PCR مدرن معمولاً از یکی از دو منبع باکتری گرمادوست، Thermus aquaticus یا Pyrococcus furiosus  تهیه می شوند. این پلیمرازها به ترتیب، Taq  و Pfu نام دارند. این آنزیم ها به راحتی در برابر دماهای بالا همراه با واکنش PCR مقاومت می کنند. پلیمرازهای تجاری Taq و Pfu  برای افزایش سرعت، تکمیل خوانش طولانی توالی و توانایی خواندن الگوهای غنی از GC مهندسی شده اند.

DNA الگو

این DNA است که شما آغازگر(پرایمر) های خود را بر اساس آن طراحی می کنید. این DNA است که پلیمراز شما آن را شناسایی می کند و شروع به تکثیر رشته جدید از رشته الگو می کند. الگوی شما می تواند DNA ژنومی، پلاسمید یا cDNA باشد، اما هرچه DNA الگوی شما دست نخورده و خالص تر باشد، دستیابی به نتایج خوب PCR راحت تر است. همچنین بخاطر داشته باشید که مقدار ایده آل DNA به منبع شما بستگی دارد، معمولاً ۱ گرم – ۱ نانوگرم DNA پلاسمید یا ۱ نانوگرم – ۱ میکروگرم DNA ژنومیک در هر واکنش PCR استفاده می شود.

آغازگرها(پرایمر ها)

پرایمر ها قطعات کوتاه DNA سنتز شده هستند که به DNA الگوی شما متصل می شوند. شما باید یک آغازگر “فوروارد” و یک آغازگر “ریورس” را طراحی کنید. آغازگر رو به جلو( پرایمر فوروارد) شروع PCR شما را مشخص می کند. توالی این پرایمر همان توالی DNA الگوی ۵´-۳´ شماست. آغازگر معکوس(پرایمر ریورس) شما پایان PCR شما را مشخص می کند. توالی این پرایمر مکمل معکوس DNA الگوی شماست. بطور کلی طول آغازگرها ۱۸-۲۲ جفت باز است. با این حال، مهمتر از طول آن ها دمای ذوب (Tm) آغازگرهای شما است. دمای ذوب آغازگرهای شما باید ۵۴-۶۰ درجه سانتی گراد و تا حد امکان شبیه به یکدیگر باشد. تعداد زیادی نرم افزار های آنلاین وجود دارد که می تواند دمای Tmو دمای انلینگ آغازگر را محاسبه کند و اکثر شرکت هایی که مبدل های اولیه را تولید می کنند چنین نرم افزار هایی را تهیه می کنند.

نوکلئوتیدها

به عنوان مونومرهای DNA، نوکلئوتیدها برای تهیه کپی DNA لازم هستند. برای اکثر PCR های DNA از تری فسفات Deoxynucleoside (dNTP) استفاده می شود. می توان این نوکلئوتید ها را جداگانه یا به صورت مخلوط dGTP ، dCTP ، dATP و dTTP خریداری کرد.

بافر

اکثر پلیمرازهای تجاری با بافر ایده آل خود عرضه می شوند. این بافرها نه تنها pH صحیح را تأمین می کنند، بلکه همیشه دارای افزودنی هایی مانند منیزیم، پتاسیم یا DMSO هستند که به بهینه سازی فعالیت های دناتوراسیون، اتصال و پلیمراز DNA کمک می کنند.

ترموسایکلینگ (Thermocycling)

این مکان جایی است که سحر و جادو اتفاق می افتد. تمام مواد تشکیل دهنده فوق به یک لوله PCR اضافه می شوند وفرایند حرارت دهی آغاز می شود. به منظور دستیابی به دماهای مورد نظر در هنگام اختراع PCR ، لوله های PCR جداگانه به صورت دستی بین حمام های آب گرم منتقل می شدند. اکنون، به لطف اختراع آقای Cycles  اکنون به طور خودکار توسط ترموسیکلرها انجام می شود. موارد زیر مشخصات حرارتی سیکلر PCR معمولی است:

دناتوراسیون (۱۵- ۴۰ بار تکرار)

در مرحله اول واکنش به مدت ۳۰ ثانیه تا چند دقیقه تا ۹۶-۹۴ درجه سانتی گراد گرم می شود. این مرحله معمولاً فقط یک بار در ابتدای واکنش PCR شما انجام می شود. این مرحله برای فعال کردن نقطه داغ آنزیم پلیمراز، و همچنین برای تکمیل DNA الگو، مهم است. به خاطر داشته باشید که اگر محتوای GC الگوی شما زیاد است، ممکن است نیاز به انجام مرحله اولیه طولانی مدت داشته باشید.در این مرحله DNA تخریب می شود ، و به پرایمر و DNA الگو اجازه  داده می شود تا در مرحله بعدی انلینگ صورت گیرد.

مرحله اتصال(Anneling)

در این مرحله، دمای واکنش شما به سرعت و برای مدت ۴۰-۲۰ ثانیه به ۵۰-۶۴ درجه سانتی گراد کاهش می یابد. درجه حرارت در این مرحله باید به اندازه کافی پایین باشد تا آغازگرها بتوانند جفت بازهای Watson-Crick را با DNA الگوی شما تشکیل دهند. اما دما به اندازه کافی بالا است که فقط پایدارترین ساختارهای دو رشته ای (کاملاً جفت شده) می توانند تشکیل شوند. معمولاً این دمای انلینگ چند درجه پایین تر از دمای ذوب جفت آغازگر شما است. همچنین طی این مرحله پلیمراز شما به مجموعه DNA آغازگر / الگو شما متصل می شود. اگرچه در مرحله بعدی پلیمراز شما شروع به خواندن نمی کند.

 مرحله پلیمرازیسیون یا طویل شدن (Extension/Elongation Step)

در این مرحله واکنش شما به سرعت تا ۸۰-۷۲ درجه سانتی گراد گرم می شود. این زمانی است که پلیمراز شروع به خواندن (در جهت ۵´-۳´) و کپی کردن DNA الگو (در جهت ۳´-۵´) می کند. دمای بالاتر در طی این مرحله فعل و انفعالات DNA آغازگر / الگو را کاهش می دهد، بنابراین ویژگی واکنش شما افزایش می یابد. به طور معمول، DNA  پلیمراز می تواند ۱۰۰۰ جفت باز را در دقیقه متصل کند. در پایان این انکوباسیون قطعات جدیدی از رشته های DNA ایجاد می شود که از هر دو الگو و DNA جدید تشکیل شده است.

ادامه PCR بعد از مرحله اول

تمامی سیکل های بعدی، تکرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد.به طور کلی در هر سیکل ۲ⁿ  مولکول DNA خواهیم داشت که که n تعداد سیکل های دمایی است.

مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (T_m)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یون های دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

نگهداری نهایی (Final hold)

در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است. این یک مرحله اختیاری است اما اغلب توصیه می شود. در این مرحله واکنش برای دقایقی در دمای ۷۰-۷۴ درجه سانتی گراد انجام می شود. این مرحله به پلیمرازها اجازه می دهد هر رشته ای را که در حال حاضر هستند خواندن را به پایان برسانند. این مرحله اختیاری می تواند به کاهش تعداد نسخه های کوتاه شده در محصول نهایی شما کمک کند.

ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز به همراه مارکر مولکولی با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، بررسی نمود.درست است که هرچه سیکل های بیشتری را برنامه ریزی کنید، کپی DNA بیشتری ایجاد خواهید کرد. با این حال، یکسری محدودیت برای تعداد سیکل های PCR وجود دارد.

نگه داشتن نهایی

واکنش شما اکنون کامل شده است. کل فرآیند PCR بصورت خودکار انجام می شود و تنها در عرض چند ساعت قابل انجام است.

نکاتی درمورد تکنیک PCR

امروزه مستر میکس های PCR به طور آماده برای انجام تکنیک به فروش می رسد.برای جلوگیری از تبخیر در یک سیکلر حرارتی بدون درپوش گرم، روغن معدنی اضافه کنید.

انواع واکنش زنجیره ای پلیمرازPCR

چندین اصلاح روش PCR برای افزایش کاربرد این روش در تنظیمات تشخیصی بر اساس کاربردهای آنها ایجاد شده است. برخی از انواع رایج PCR عبارتند از:

Real time PCR(Quantitative PCR or qPCR)

Reverse-Transcriptase (RT-PCR)

Multiplex PCR

Nested PCR

High Fidelity PCR

Fast PCR

Hot Start PCR

GC-Rich PCR

Long-range PCR

Arbitrary Primed PCR

امروزه انواع واکنش های PCR توسط دستگاهی به نام ترموسایکلر هدایت می شود، که برای تغییر دمای واکنش هر چند دقیقه برنامه ریزی می شود.

دستگاه ترموسایکلر

دستگاه ترموسایکلر حرارتی (همچنین به عنوان ترموسایکلر، دستگاه PCR یا تکثیر کننده DNA شناخته می شود) دستگاه آزمایشگاهی است که معمولاً برای تقویت بخش های DNA از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده می شود. همچنین ممکن است از سیکلرهای حرارتی در آزمایشگاه ها برای تسهیل سایر واکنش های حساس به دما، از جمله هضم آنزیم محدود کننده یا تشخیص سریع استفاده شود.

ترموسیکلرها یا سایکلرهای حرارتی، ابزاری هستند که برای تکثیر نمونه های DNA و RNA توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده می شوند. ترموسایکلر در مراحل گسسته و از قبل برنامه ریزی شده، دمای نمونه ها را در یک بلوک نگهدارنده، بالا و پایین می آورد، اجازه می دهد تا دناتوراسیون و رناتوراسیون نمونه ها با معرف های مختلف انجام شود. از مواد ژنتیکی تکثیر شده می توان در بسیاری از برنامه های پایین دستی مانند شبیه سازی، تعیین توالی، تجزیه و تحلیل بیان و ژنوتیپ استفاده کرد.

 

کمپانی های بسیاری هستند که از ترموسیکلرها مانند BioRad ، Thermo ، Eppendorf استفاده می کنند و دارای تنظیمات اساسی با برخی ویژگی های خاص هستند.

اجزا دستگاه

این دستگاه دارای یک بلوک حرارتی با مخزن هایی است که می توان لوله های نگهدارنده مخلوط واکنش را در آن قرار داد. سپس دما در مراحل مجزا و از قبل برنامه ریزی شده دمای بلوک را بالا و پایین می آورد.

دستگاه های ترموسایکلر جز لاینفک تحقیقات علوم زندگی هستند. در زیست شناسی مولکولی از آن ها برای تعیین توالی DNA، شبیه سازی، تولید پروب ها، کمی سازی DNA و RNA، مطالعه الگوهای بیان ژن، تشخیص مکان های دارای برچسب توالی و بسیاری از تکنیک ها استفاده می شود.

چندین دستگاه PCR و سیستم های PCR در زمان واقعی برای استفاده آموزشی در دسترس هستند. همه ترموسیکلرها از نوع ماشین آلات استاندارد کاملاً کاربردی هستند.

کاربرد های دستگاه ترمو سایکلر

کنترل دقیق دما و توانایی نگه داشتن دمای دقیق تنظیم شده با نوسانات اندک نیز برای سایر تکنیک هایی که در آن کنترل درجه حرارت با دقت بالا قابلیت تولید مجدد بین آزمایش ها را افزایش می دهد قابل استفاده است. افزایش سطح کنترل دما ارائه شده توسط یک ترموسیکلر امکان مطالعه سینتیک وابسته به دما را فراهم می کند. به عنوان مثال، علاوه بر بهینه سازی پروتکل PCR، یک ترموسیکلر با ویژگی گرادیان امکان تعیین درجه حرارت مطلوب برای هر فعالیت آنزیمی را فراهم می کند.

استفاده از ترموسیکلر در آموزش

برای آموزش علوم زندگی، یک ترموسایکلر ابزار خوبی برای علوم مبتنی بر تحقیق است. دانش آموزان ضمن یادگیری نحوه استفاده از تجزیه و تحلیل PCR به روش های عملی، در معرض طیف وسیعی از اصول علمی هستند. دانش آموزان می توانند نحوه استفاده از PCR در زمینه هایی مانند پزشکی قانونی، تشخیص، حفاظت از حیوانات و باستان شناسی را بیاموزند. تعدادی کیت سرگرم کننده تقویت PCR برای آموزش برنامه های PCR در دنیای واقعی در دسترس است، به عنوان مثال، کیت مقدماتی Crime Scene PCR Basics and

استفاده از ترموسیکلر در تشخیص عوامل پاتوژن در مواد غذایی

سرعت یک نکته مهم برای آزمایش مواد غذایی برای عوامل بیماری زا است. بسیاری از مواد غذایی فاسد شدنی هستند، بنابراین آزمایش باید خیلی سریع انجام شود، در غیر این صورت مواد غذایی پس از اتمام آزمایش ماندگاری کافی ندارند. برای پاتوژنهای بسیار خطرناک مانند E. coli O157: H7، سرعت و حساسیت بسیار مهم است. این پاتوژن را می توان با استفاده از کیت PCR در کمتر از ۱۲ ساعت تشخیص داد. کشت و ELISA اصلی ترین روش برای آزمایش پاتوژن های اصلی مواد غذایی برای چندین سال بود. اخیرا ، سنجش های PCR و توانایی ادغام کامل ترموسایکلر در گردش کار خودکار باعث شده است که آزمایش پاتوژن سریعتر و حساس تر شود و از این طریق توان عملیاتی بالاتری داشته باشد.دستگاه ترموسایکلر PCR دقیق تر و سریعتر از ELISA است. افزایش حساسیت بدین معناست که احتمالاً قبل از سنجش به مرحله غنی سازی نیاز نیست. با این کار زمان کلی برای رسیدن به نتیجه کوتاه می شود و زمان عملی لازم نیز به حداقل می رسد.

استفاده از PCR خودکار برای آزمایش پاتوژن، علاوه بر افزایش سرعت، توان عملیاتی بالاتری را ایجاد می کند، آلودگی را کاهش می دهد، سطح مثبت کاذب را کاهش می دهد و از تنوع بین لایه ای می کاهد.بعلاوه، کیت های PCR توسط چندین نهاد صدور گواهینامه تأیید می شوند. مطالعات اعتبارسنجی نشان داده است که کیت های PCR معادل یا بهتر از روشهای مختلف مرجع ارزیابی شده در حالی که نتایج را در زمان بسیار کمتری ارائه می دهند.

انتخاب یک ترموسایکلر

مجموعه ای از انواع و کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز، از PCR معکوس (RT-PCR) گرفته تا Droplet Digital ™ PCR، در حال افزایش است. اینکه کدام یک از ترموسایکلرها یا ترموسایکلرها را انتخاب کنید، به نیاز فعلی و پیش بینی شده آینده بستگی دارد. ملاحظات هنگام انتخاب ترموسایکلر شامل موارد زیر است:

انواع پروتکل های PCR مورد استفاده

سطح حساسیت مورد نیاز

تعداد نمونه هایی که باید همزمان تقویت شوند

محدوده حجم نمونه (تحلیلی تا مقدماتی)

معاملات بین عملکرد و ویژگی

آیا قابلیت شیب مورد نیاز است

زمان اجرای پروتکل (به عنوان مثال، برای Fast PCR)

تعداد کاربران

 

منابع :

https://bitesizebio.com/19132/pcr-basics-what-is-pcr/

https://www.sensoquest.de/what-is-a-thermocycler/?lang=en

https://www.bio-rad.com/featured/en/thermocycler.html

https://microbeonline.com/polymerase-chain-reaction-pcr-steps-types-applications/

جهت کسب اطلاعات از قیمت ترموسایکلر و خرید با ما تماس بگیرید.